Tuntuu etten ole kuukaudessa edennyt mihinkään. Siispä jatkan aivan samasta aiheesta kuin viimeksikin - suosirrin mikrosatelliittiaineiston käsittelystä. Takana on kiireisin kuukausi pitkään aikaan, ja töitä on tullut tehtyä reippaalla tahdilla, mutta hommaa on niin paljon että tässä menee varmasti vielä aikaa.
Löysin aineistosta kaikenlaisia virheitä, ja olen nyt käynyt läpi kaikkien noin 600 yksilön yhdentoista mikrosatelliittilokuksen alleeleita, lokus kerrallaan. Kun saan tämän valmiiksi, voin hyvillä mielin todeta että pohjatyö on nyt tehty kunnolla ja aineistoon voi luottaa (vaikka toki sinne varmasti joitain virheitä aina jää). Alussa tuntui että edessä on aivan loppumaton urakka, mutta pakkohan tämä on tehdä, muuten tulee epäkelpoja tuloksia. Viimeiset pari viikkoa tätä on tehnyt ihan hyvillä mielin, eipähän tekeminen lopu!
Huomasin monissa tapauksissa virheen mikrosatelliittiajoissa mukana olevassa kokostandardissa, aineessa, jonka perusteella tietokoneohjelma tunnistaa ja ilmoittaa analysoiduille yksilöille niiden alleelien pituudet. Jos kokostandardi on väärin luettu, alleelikoot menevät pieleen. Ainetta siis kirjaimellisesti pipetoidaan jokaisen näytteen kanssa samaan kuoppalevyn kaivoon. Kukin näyte ajetaan elektroforeesilaitteen läpi, jossa DNA kulkeutuu tietyllä nopeudella (pidemmät DNA-pätkät hitaammin, lyhyemmän pätkät nopeammin), ja tietokone hoitaa alleelien tunnistamisen ja niiden kokojen määrittämisen juuri kokostandardin avulla.
Alla on esimerkki tapauksesta, jossa GeneMapper on laittanut kokostandardin 139-emästä pitkän piikin väärään paikkaan (vasemmalla). Tummalla on merkitty sen oikea paikka. Joudun manuaalisesti klikkaamaan kokostandardipiikkiä, deletoimaan väärän koon, klikkaamaan oikeaa piikkiä, ja lisäämään siihen äsken deletoidun numeron (oikealla).
Yksinkertaisimmissa tapauksissa homma on sillä selvä, ja alleelit ovat korjauksen jälkeen oikeilla paikoillaan, oikean pituisina. Joissain tapauksissa kaikki piikit ovat kuitenkin väärin merkittyjä. Siinä on hiirikäsi kovilla kun klikkailee ja muuttelee kokostandardien kokoja pitkin päivää.
Alla on sitten esimerkki siitä, miten alleelikoko muuttuu kun kokostandardi korjataan. Väritin pinkillä alleelipiikeistä sen osan, jonka perusteella alleelikoko on määritetty. Vasemmalla olevassa kuvassa kokostandardi on väärä, joten suosirriyksilö numero 269 näyttäisi olevan Calp2-mikrosatelliittilokuksen suhteen heterotsygootti alleelein 128/140 (vaikka oikeastaan alleelit näyttäisivät pikemminkin osuvan kohdille 127 ja 139 - tämä oli siis hieman epäselvä tapaus, jonka perusteella tajusin lähteä etsimään virhettä kokostandardista). Oikealla näkyy sama yksilö kokstandardin korjauksen jälkeen. Nyt alleelit ovatkin selvästi 126/138!
Pienikin virhe kokostandardissa voi siis muuttaa alleelikokojen tulkitsemista. Koska virheitä näytti löytyvän kymmenistä yksilöistä, päädyin siihen että kaikki yksilöt täytyy käydä läpi ennen kuin aineiston perusteella voi tehdä huolellisia analyysejä.
Tällä hommalla jatketaan, mutta toivottavasti ei aivan koko loppukevättä. Päivän tietokoneella istumisen jälkeen olen rentoutunut lähinnä siementen (nyt jo taimien) ja mullan parissa. Ja iltaisin taustalla näkyvän teoksen merkeissä (uni tulee mukavasti tätä lukiessa:). Kesä ja chilit, täältä tullaan!
Nelli
Ei kommentteja:
Lähetä kommentti